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2016-03-27 22:55:34 365彩票公司 已读
本发明提供了一种利用陶瓷膜对微生物发酵的重组蛋白质365彩票网注册端液分离的方法,包括将365彩票网在0~30℃的温度下加压到0.1~0.6MPa后进入陶瓷膜过滤系统,365彩票网登录微生物和悬浮固体被截留在膜的进料一侧,流出的透过液即为重组蛋白质产物溶液。本发明实现了重组蛋白质365彩票网平台分子蛋白质产物与其他固体杂质的有效分离,具有工艺稳定、过滤后透过液澄清度好、便于后续层析处理、易于实现工业化等一系列优点。
权利要求(15)
1.一种利用陶瓷膜对重组蛋白质365彩票网进行固液分离的方法,其特征在于,将365彩票网在O〜30°C的温度下加压到0.1〜0.6Mpa后进入陶瓷膜过滤系统,365彩票网中的菌体细胞和悬浮固体被截留在膜的进料一侧,流出的渗透液即为重组蛋白质产物溶液,其中所述365彩票网的PH值为6.0-8.0,所述陶瓷膜的孔径为0.2〜1.2微米。
2.根据权利要求1所述的分离方法,其中的陶瓷膜孔径为0.5〜0.8微米。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中365彩票网温度为8〜29°C。
4.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中365彩票网温度为10〜26°C。
5.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网进入陶瓷膜过滤系统前的压力为0.2〜0.5Mpa。
6.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网进入陶瓷膜过滤系统前的压力为0.3Mpa。
7.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网的pH值为6.0。
8.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网在陶瓷膜过滤系统中的流通量为30〜100升/米2.小时。
9.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网在陶瓷膜过滤系统中的流通量为75升/米2.小时。
10.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质的分子量为I万〜8万道尔顿。
11.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中陶瓷膜过滤系统由一个或多个单元膜系统组成。
12.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质的培养宿主为真核细胞或原核细胞。
13.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网为微生物发酵的重组蛋白质365彩票网。
14.根据权利要求1或2所述的分离方法,其中重组蛋白质365彩票网选自下列之一:重组人血白蛋白365彩票网、重组人转铁蛋白365彩票网。
15.根据权利要求1或2所述的分离方法,将所述重组蛋白质365彩票网替换为重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体发酵菌体裂解液或重组L-山梨酮脱氢酶发酵菌体裂解液,其中所述发酵菌体裂解液包含微生物菌体碎片、悬浮固体和可溶性重组蛋白质产物,其由365彩票网的菌体经超声裂解获得。
说明

一种重组蛋白质365彩票网的分离方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物365彩票网分离方法,特别涉及一种对微生物发酵的重组蛋白质365彩票网的分离方法。

背景技术

[0002] 在生物发酵液分离领域,重组蛋白质发酵液的分离方法目前主要包括离心技术、板框过滤技术和膜分尚技术。

[0003] 离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。利用该技术进行固液分离在多个领域广泛应用,诸如分离出化学反应后的沉淀物,天然的生物大分子、无机物、有机物,在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。随着技术的进步,针对不同状态的料液,发展了包括叠片式离心机和连续流离心机在内的多种离心手段,但这些离心技术存在着其固有的难以克服的缺点,包括运行动力成本高、难以处理大量的高含固量的料液等。

[0004] 板框过滤技术用于重组蛋白质药物生产中的固液分离,其优点是设备投入少,成本低,其缺点是需要较大的人力投入,存在大量的人工操作,从而难以实现很好的批次重复性;完全的密封困难,产品收率低;染菌料液处理困难,难以保证不同料液澄清度一致(中国生物工程杂志,2004,24 (4):81-85)。

[0005] 膜分离技术中,根据所用膜的材料可分为高分子膜、无机膜和液体膜。常用的是高分子膜,其次是无机膜。高分子膜材料有纤维素类、聚酰胺类、芳香杂环类、聚砜类、聚烯烃类、硅橡胶类、含氟高分子类等。高分子膜优点是种类多,可选择性大,价格低,膜组件结构较简单等;缺点是化学稳定性和热稳定性差,易受微生物降解,易压密等。无机膜多以金属、金属氧化物、陶瓷等制成,可以耐高温、高压,化学性质稳定,寿命长,物料通量大,允许使用苛刻的清洗条件;缺点是膜脆,易碎,设备费高(膜分离技术,化学工业出版社,1998)。常用的高分子膜膜组件结构型式主要有平板式、管式、卷式和中空纤维式4种。平板式膜组件常用板框式结构,其优点是膜的清洗和更换容易,料液流通截面积大,不易堵塞;缺点是密封难度大,部件加工精度要求高,料液流程短,为达到一定浓缩度需多次循环,常用于小型选膜实验中。管式膜组件结构原理类似于管式换热器,它的优点是料液流速可调范围大,可处理悬浮固体浓度较高的料液,清洗方便;缺点是单位体积膜面积较小,造价高。卷式膜组件结构与螺旋板换热器类似,单位体积中膜面积大;但压力降大,膜层间易堵塞,清洗困难。中空纤维膜的外径为0.5〜2mm,可在膜组件内自行支撑,膜组件单位体积内膜面积大,压力降小;但是易堵塞,料液需要预处理(河北科技大学学报,2002,23 (3):21-26)。

[0006] 陶瓷膜在生物化工领域的应用涉及细胞脱除、无菌水生产以及低分子有机物的澄清和生物膜反应器等。目前,陶瓷膜在制药产业中的应用主要涉及微生物制药中小分子生物发酵液的固液分离。蔡跃明等公开了利用陶瓷膜分离乳酸、酒精等小分子生物发酵液的方法(CN1245247C,2006.3.15)。Kim 等(J CleanerProd, 1997,5(4):263 〜267)用截流相对分子质量为50000的无机陶瓷膜超滤釜馏物,截流的大分子和固体残渣经离心机处理后压成饼柏,渗透液的主要成分是水和小分子还原糖。

[0007] 微生物发酵的重组蛋白质发酵液,例如,重组人血白蛋白发酵液、重组人转铁蛋白发酵液等酵母发酵液以及重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体发酵菌体裂解液、重组L-山梨酮脱氢酶发酵菌体裂解液等大肠杆菌发酵菌体裂解液等,该类发酵液的待分离物质均为数万道尔顿的大分子蛋白产物,而且还含有菌体细胞和悬浮固体等杂质。对于上述重组蛋白质发酵液的分离方法,本领域技术人员急需一种有效的解决方案。

发明内容

[0008] 发明人通过多年研究,利用陶瓷膜对多种重组蛋白质发酵液进行了大量的实验,成功地实现了大分子蛋白质产物与菌体细胞、悬浮固体等杂质的有效分离。

[0009] 具体地,本发明涉及:

[0010] (I) 一种利用陶瓷膜对重组蛋白质发酵液进行固液分离的方法,其特征在于,将发酵液在O〜30°C的温度下加压到0.1〜0.6Mpa后进入陶瓷膜过滤系统,发酵液中的菌体细胞和悬浮固体被截留在膜的进料一侧,流出的渗透液即为重组蛋白质产物溶液。

[0011] (2)根据项(I)所述的分离方法,其中的陶瓷膜孔径为0.01〜2微米,优选为0.2〜1.2微米,特别优选为0.5〜0.8微米。

[0012] (3)根据项⑴或⑵所述的分离方法,其中发酵液温度为8〜29°C,优选为10〜26。。。

[0013] (4)根据项(I)或(2)所述的分离方法,其中重组蛋白质发酵液进入陶瓷膜过滤系统前的压力为0.2〜0.5Mpa,优选为0.3Mpa。

[0014] (5)根据项(1)或⑵所述的分离方法,其中重组蛋白质发酵液的pH值为5.0〜

8.0,优选为6.0。

[0015] (6)根据项(1)或(2)所述的分离方法,其中重组蛋白质发酵液在陶瓷膜过滤系统中的流通量为30〜100升/米2.小时,优选为75升/米2.小时。

[0016] (7)根据项(I)或(2)所述的分离方法,其中重组蛋白质的分子量为I万〜8万道尔顿。

[0017] (8)根据项(I)或(2)所述的分离方法,其中陶瓷膜过滤系统由一个或多个单元膜系统组成。

[0018] (9)根据项(I)或(2)所述的分离方法,其中重组蛋白质的培养宿主为真核细胞或原核细胞。

[0019] (10)根据项(I)或(2)所述的分离方法,其中重组蛋白质发酵液为微生物发酵的重组蛋白质发酵液。

[0020] (11)根据项⑴或⑵所述的分离方法,其中重组蛋白质发酵液选自下列之一:重组人血白蛋白发酵液、重组人转铁蛋白发酵液、重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体发酵菌体裂解液或重组L-山梨酮脱氢酶发酵菌体裂解液。

[0021] 本发明使用的陶瓷膜过滤系统可以由单个或多个陶瓷膜组成,其中的陶瓷膜(购自江苏久吾高科股份有限公司)孔径为0.01〜2微米,优选为0.2〜1.2微米,特别优选为0.5〜0.8微米。所述陶瓷膜过滤系统也可以由一个或多个单元膜系统组成,其中的单元膜系统由多个陶瓷膜组成。上述陶瓷膜过滤系统或单元膜系统的组成方法为本领域的惯常手段,按照厂家说明书操作即可。本领域技术人员应当明白,为满足对重组蛋白质产物溶液不同产量的要求,所述陶瓷膜过滤系统可以使用不同数量的陶瓷膜或单元膜系统。

[0022] 本发明中的重组蛋白质为利用分子生物学手段将目的基因导入原核或真核细胞中,利用发酵法生产目的基因所表达的蛋白质,培养宿主为酵母等真核细胞,也可以是原核细胞。作为举例,本发明的重组蛋白质可以是微生物发酵的重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体或重组L-山梨酮脱氢酶。

[0023] 进一步地,重组蛋白质发酵液进入陶瓷膜过滤系统前的压力为0.1〜0.6Mpa,优选为0.2〜0.5Mpa,特别优选为0.3Mpa。发酵液温度为O〜30°C,优选为8〜29°C,特别优选为10〜26°C,根据蛋白质的性质,温度控制可以是恒温,也可以是变温。发酵液pH值为5.0〜8.0,优选为6.0。发酵液在陶瓷膜过滤系统中的流通量为30〜100升/米2 •小时,优选为75升/米2.小时。

[0024] 与采用连续流离心机或中空纤维膜等传统分离工艺相比,本发明的重组蛋白质发酵液的分离方法,除了具有陶瓷膜的化学稳定性好(耐酸、耐碱、耐氧化、耐有机溶剂),耐高温,机械强度大,耐磨性好,分离精度高(可达纳米级过滤)以及易清洗等优点之外,还具有工艺稳定、成本低廉、分离精度极高,所需人力少,能够与后续的层析处理达到更好的衔接,非常易于工业化等优点。

[0025] 具体地,本发明通过控制陶瓷膜过滤系统中重组蛋白质发酵液的温度、压力、流通量和陶瓷膜孔径等参数,可以实现料液的高澄清度分离,降低层析的上柱压力,提高层析柱处理流速,实现了与后续层析处理的更好衔接,提高了工作效率。另外,本发明提供的方法在大规模生产中可以采用小规模实验中所确定的工艺参数,如陶瓷膜流道长度和管径,只需数量上的线性增加,非常易于工业化放大,具有极高的产业化应用价值。

附图说明

[0026] 图1为陶瓷膜过滤系统流路示意图。

[0027] 图2为重组人血白蛋白发酵液SDS-PAGE电泳图,其中泳道A为离心后上清,泳道B为经过陶瓷膜过滤后上清,泳道C为蛋白质分子量标准从大到小为(97400,66200,43000,31000)。

[0028] 图3为重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体发酵液SDS-PAGE电泳图,其中泳道A为离心后上清,泳道B为经过陶瓷膜过滤后上清,泳道C为蛋白质分子量标准从大到小为(97400,66200,43000,31000,20100,14400)。

[0029] 图4为重组L-山梨酮脱氢酶发酵液SDS-PAGE电泳图,其中泳道a为离心后上清PBAD/SND,泳道b为蛋白质分子量标准从大到小为(94000,67000,43000,30000)。

[0030] 图5为重组人血白蛋白发酵液在陶瓷膜过滤系统中的通量衰减曲线。

[0031] 图6为重组 -山梨酮脱氢酶发酵菌体裂解液在陶瓷膜过滤系统中的通量衰减曲线。

具体实施方式

[0032] 下述实施例具体阐述本发明重组蛋白质发酵液的分离方法,仅为本领域技术人员更好地理解本发明,不应解释为对本发明的限制。[0033] 实施例1利用陶瓷膜过滤重组人血白蛋白发酵液

[0034] 应用自有专利申请技术(CN1854301A和CN1854306A)构建的基因工程菌及生产方法获得重组人血白蛋白发酵液,其菌体浓度为40 %,蛋白质浓度16g/L,蛋白质分子量为66KD。

[0035] 在24_30°C下,将上述发酵液(pH值为6.0)加压到0.3Mpa后直接进入陶瓷膜过滤系统(陶瓷膜孔径为0.5微米)。发酵液中的酵母细胞和悬浮固体等被截留在膜的进料一侧,通过回流通路回到原料罐,而渗透液即为重组蛋白质产物溶液。当湿重达到60% (进料50L,渗透液为21L)时,开始通过清洗通路进行流加水操作,共流加水20L,当检测到回流的滤渣液中湿重70%,滤渣液上清蛋白质浓度低于lg/L时停止收集,共获得上清液45L。发酵液在陶瓷膜过滤系统中的通量衰减曲线见附图5。发酵液电泳结果见图2。具体实验数

据见下表。

[0036]

[0037] 实施例2利用陶瓷膜过滤重组人转铁蛋白发酵液

[0038] 应用自有技术构建的表达人转铁蛋白的酿酒酵母工程菌,经发酵所获得发酵液的菌体浓度为20%,蛋白质浓度0.lg/L,蛋白质分子量为75KD。在24-26°C下,将上述发酵液(pH值为6.0)加压到0.2Mpa后直接进入陶瓷膜过滤系统(陶瓷膜孔径为1.2微米),发酵液中的酵母细胞、悬浮固体等被截留在膜的进料一侧,通过回流通路回到原料罐,而渗透液即为重组蛋白质产物溶液。当湿重达到60% (进料30L,渗透液为15L)时,开始通过清洗通路进行流加水操作,共流加水12L,当检测到回流的滤渣液中湿重70%,滤渣液上清蛋白质浓度低于0.005g/L时停止收集,获得上清液15L,累计获得上清液30L。具体实验数据见下表。[0039]

[0040] 实施例3利用陶瓷膜过滤重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体发酵菌体裂解液

[0041] 应用自有技术构建的表达重组肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的大肠杆菌工程菌,经发酵所获得发酵液的菌体浓度为10%,目标蛋白质浓度为5g/L,蛋白质分子量为18KD。在4°C下超声裂解菌体,将上述裂解液(pH值为7.0,固形物浓度为7%,离心称重法测定)在10-15°C下加压到0.5Mpa后直接进入陶瓷膜过滤系统(陶瓷膜孔径为0.2微米),裂解液中的微生物菌体碎片、悬浮固体等被截留在膜的进料一侧,通过回流通路回到原料罐,而渗透液即为重组蛋白质产物溶液。当湿重达到50% (进料30L,渗透液为25L)时,开始通过清洗通路进行流加水操作,共流加水10L,当检测到回流的滤渣液中湿重70%,滤渣液上清蛋白质浓度低于0.lg/L时停止收集,获得上清液11L,累计获得上清液36L。发酵液

电泳结果如图3所示。具体实验数据见下表。

[0042]

平均通量43L/m2.h 总收率:97%,其中以离心收率为100%

[0044] 实施例4利用陶瓷膜过滤重组L-山梨酮脱氢酶发酵菌体裂解液

[0045] 利用自有专利技术(ZL200310116831.7)构建的基因工程菌进行发酵,所获得大肠杆菌发酵液的菌体浓度为4%,蛋白质浓度2g/L,蛋白质分子量为45KD,

[0046] 将发酵液进行收集后,5000r/min下离心5min收集菌体,用pH8.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗涤3次,按照1:10的比例将离心后的菌体溶解于超声缓冲液(预冷的生理盐水或pH8.0的Tris-HCl)中,500w,10s/10s破碎20分钟。在4°C下,将上述超声裂解液(pH值为8.0)加压到0.3Mpa后直接进入陶瓷膜过滤系统(陶瓷膜孔径为0.5微米),裂解液中的悬浮固体(包括细胞碎片和包涵体)被截留在膜的进料一侧,通过回流通路回到原料罐,而渗透液即为重组蛋白质产物溶液。当湿重达到30%时,开始通过清洗通路进行流加水操作,共流加水25L,当检测到回流的滤渣液上清蛋白质浓度低于0.05g/L时停止收集,共获得上清液61L。发酵液电泳结果如图4所示。裂解液在陶瓷膜过滤系统中的通量衰减曲线见附图6。具体实验数据见下表。

[0047]

[0048] 实施例5利用陶瓷膜过滤,实现更好的层析衔接

[0049] 将重组人血白蛋白发酵液分别进行离心(15°C,5000转/分,30分钟)和陶瓷膜过滤(实施例1)处理,离心后上清中有微量的固体悬浮,陶瓷膜透过液的澄清度明显较高;将上述离心后上清和陶瓷膜透过液以同样的纯化工艺(申请人自有专利技术EP1504031B1,层析柱采用BPG140)处理,陶瓷膜透过液的层析上柱压力较低(同样线性流速下,离心后上清的上柱压力为0.15MPa,陶瓷膜透过液的上柱压力为0.09Mpa)。同样的上柱压力条件下,陶瓷膜透过液的上柱流速较高(离心后上清的上柱流速为80cm/h,陶瓷膜透过液的上柱流速120cm/h),上样时间较离心后上清缩短了 50%,提高了层析工作效率,从而实现了更好的工艺衔接。

[0050] 实施例6陶瓷膜过滤的工业化放大试验

[0051] 利用重组人血白蛋白发酵液进行三个阶段的实验。第一阶段利用单个陶瓷膜完成,操作的具体参数为:陶瓷膜孔径为0.5微米,发酵液循环过滤系统温度维持25V’泵入压力0.3MPa。当湿重达到60%时,开始通过清洗液通路进行流加水操作,流加水体积为初始发酵液体积的0.5倍,当检测到回流的滤渣液中湿重70%,滤渣液上清蛋白质浓度低于lg/L时停止收集。第二阶段和第三阶段分别利用系统化集成16个和288个陶瓷膜(膜面积分别为3.5平方米和63平方米)进行中试和生产水平的实验,实验参数与第一阶段相同。

[0052] 对比三个阶段所收获的分离后的发酵液质量,澄清度相当,层析上柱压力维持在

0.09MPa,上柱流 速均达到120cm/h。